mRNA藥物制備的關(guān)鍵技術(shù)——切向流過濾的高效應(yīng)用
時(shí)間：2024.07.15
mRNA藥物作為一種新型的生物制藥技術(shù)，因其在治療和預(yù)防疾病方面的潛力而受到廣泛關(guān)注。切向流過濾（TFF）技術(shù)高效率、高回收率特點(diǎn)，在mRNA藥物制備中作用很大。
一、什么是mRNA？
mRNA是細(xì)胞中的一種核糖核酸，它攜帶遺傳信息，指導(dǎo)細(xì)胞制造特定的蛋白質(zhì)。在mRNA藥物中，人工合成的mRNA被設(shè)計(jì)用來編碼治療性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以用于治療或預(yù)防疾病。
二、mRNA藥物工作原理
編碼設(shè)計(jì)：科學(xué)家設(shè)計(jì)并合成一段特定的mRNA序列，這段序列編碼了一種治療性的蛋白質(zhì)。
傳遞進(jìn)入細(xì)胞：為了確保mRNA藥物有效進(jìn)入患者細(xì)胞內(nèi)，需要一種有效的傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)納米顆粒（LNP），對(duì)其進(jìn)行包裹保護(hù)，防止mRNA在到達(dá)作用部位前被酶解或無法穿透細(xì)胞膜。
蛋白質(zhì)合成：一旦mRNA進(jìn)入細(xì)胞，它就會(huì)被細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制識(shí)別，并指導(dǎo)細(xì)胞合成所需的治療性蛋白質(zhì)。
傳遞進(jìn)入細(xì)胞：為了確保mRNA藥物有效進(jìn)入患者細(xì)胞內(nèi)，需要一種有效的傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)納米顆粒（LNP），對(duì)其進(jìn)行包裹保護(hù)，防止mRNA在到達(dá)作用部位前被酶解或無法穿透細(xì)胞膜。
蛋白質(zhì)合成：一旦mRNA進(jìn)入細(xì)胞，它就會(huì)被細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制識(shí)別，并指導(dǎo)細(xì)胞合成所需的治療性蛋白質(zhì)。
三、TFF技術(shù)在mRNA藥物制備中的應(yīng)用
1、mRNA生產(chǎn)工藝步驟
mRNA的生產(chǎn)工藝步驟基本上分為以上三個(gè)步驟，質(zhì)粒DNA原液制備的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄模板的序列設(shè)計(jì)，制備方法通常采用質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，也可采用PCR擴(kuò)增。以DNA擴(kuò)增為例，通常采用工程菌E.coli發(fā)酵來擴(kuò)增。先進(jìn)行菌種復(fù)蘇，質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)、收獲澄清、精制純化、線性化、分裝儲(chǔ)存等步驟。mRNA原液制備主要工藝包括將線性化質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)錄（IVT）為mRNA，進(jìn)行化學(xué)修飾后分離純化，純化后的mRNA原液分裝凍存。mRNA制劑的主要工藝包括mRNA-LNP包封制備、純化、除菌過濾、無菌灌裝等。我們本文將重點(diǎn)討論哪些步驟需要用到TFF工藝，如何選擇膜包和中空纖維，具體用到哪些規(guī)格等。
2、質(zhì)粒DNA原液制備
上游質(zhì)粒擴(kuò)增的主要工藝是通過E.coli發(fā)酵，培養(yǎng)結(jié)束后，需要對(duì)菌體進(jìn)行收集。實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)受限于其操作，難以滿足商業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)，工業(yè)上連續(xù)流離心機(jī)剪切力較高。而中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量、高粘度、剪切敏感的樣品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纖維膜柱，去除細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基組分。接下來采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎、超聲裂解、堿裂解進(jìn)行菌體裂解，通過深層過濾進(jìn)行澄清。為便于層析純化，在層析上樣前，先采用TFF進(jìn)行濃縮和換液，以大大減少樣品體積，同時(shí)去除部分RNA、HCP、HCD等雜質(zhì)。
依據(jù)質(zhì)粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通過層析進(jìn)行精制純化。經(jīng)過層析后質(zhì)粒DNA的純度已經(jīng)很高，根據(jù)線性化步驟的需要，可以先進(jìn)行超濾濃縮換液，依據(jù)質(zhì)粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，再采用限制性內(nèi)切酶完成質(zhì)粒DNA的線性化。完成線性化后，采用除菌過濾來控制微生物負(fù)荷。
由于質(zhì)粒DNA為胞內(nèi)產(chǎn)物，并且生產(chǎn)特定長(zhǎng)度和序列的mRNA需要高度純化且線性化的質(zhì)粒原料，整個(gè)下游純化過程工藝路線較為復(fù)雜，收率不高（30%~40%），這造成行業(yè)的質(zhì)粒生產(chǎn)成本較高，如何優(yōu)化和改良下游純化工藝，成為目前質(zhì)粒DNA制備環(huán)節(jié)中急需解決的問題。
mRNA的生產(chǎn)工藝步驟基本上分為以上三個(gè)步驟，質(zhì)粒DNA原液制備的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄模板的序列設(shè)計(jì)，制備方法通常采用質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，也可采用PCR擴(kuò)增。以DNA擴(kuò)增為例，通常采用工程菌E.coli發(fā)酵來擴(kuò)增。先進(jìn)行菌種復(fù)蘇，質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)、收獲澄清、精制純化、線性化、分裝儲(chǔ)存等步驟。mRNA原液制備主要工藝包括將線性化質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)錄（IVT）為mRNA，進(jìn)行化學(xué)修飾后分離純化，純化后的mRNA原液分裝凍存。mRNA制劑的主要工藝包括mRNA-LNP包封制備、純化、除菌過濾、無菌灌裝等。我們本文將重點(diǎn)討論哪些步驟需要用到TFF工藝，如何選擇膜包和中空纖維，具體用到哪些規(guī)格等。
2、質(zhì)粒DNA原液制備
上游質(zhì)粒擴(kuò)增的主要工藝是通過E.coli發(fā)酵，培養(yǎng)結(jié)束后，需要對(duì)菌體進(jìn)行收集。實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)受限于其操作，難以滿足商業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)，工業(yè)上連續(xù)流離心機(jī)剪切力較高。而中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量、高粘度、剪切敏感的樣品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纖維膜柱，去除細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基組分。接下來采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎、超聲裂解、堿裂解進(jìn)行菌體裂解，通過深層過濾進(jìn)行澄清。為便于層析純化，在層析上樣前，先采用TFF進(jìn)行濃縮和換液，以大大減少樣品體積，同時(shí)去除部分RNA、HCP、HCD等雜質(zhì)。
依據(jù)質(zhì)粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通過層析進(jìn)行精制純化。經(jīng)過層析后質(zhì)粒DNA的純度已經(jīng)很高，根據(jù)線性化步驟的需要，可以先進(jìn)行超濾濃縮換液，依據(jù)質(zhì)粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，再采用限制性內(nèi)切酶完成質(zhì)粒DNA的線性化。完成線性化后，采用除菌過濾來控制微生物負(fù)荷。
由于質(zhì)粒DNA為胞內(nèi)產(chǎn)物，并且生產(chǎn)特定長(zhǎng)度和序列的mRNA需要高度純化且線性化的質(zhì)粒原料，整個(gè)下游純化過程工藝路線較為復(fù)雜，收率不高（30%~40%），這造成行業(yè)的質(zhì)粒生產(chǎn)成本較高，如何優(yōu)化和改良下游純化工藝，成為目前質(zhì)粒DNA制備環(huán)節(jié)中急需解決的問題。
3、mRNA原液制備
體外轉(zhuǎn)錄（IVT）和修飾是mRNA原液制備的關(guān)鍵工藝，涉及多個(gè)步驟，包括轉(zhuǎn)錄、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步驟，轉(zhuǎn)錄和修飾后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纖維膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制劑等雜質(zhì)，并置換buffer。然后采用親和層析、尺寸排阻層析、離子對(duì)反相層析、離子交換層析等層析工藝進(jìn)行精制純化，經(jīng)過前述超濾、層析等純化步驟后，mRNA已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌?，再使?0kD/100kD/300kD膜包或中空纖維膜柱調(diào)整原液中mRNA濃度并置換buffer。采用除菌過濾來控制微生物負(fù)荷進(jìn)行暫存封裝。
體外轉(zhuǎn)錄（IVT）和修飾是mRNA原液制備的關(guān)鍵工藝，涉及多個(gè)步驟，包括轉(zhuǎn)錄、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步驟，轉(zhuǎn)錄和修飾后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纖維膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制劑等雜質(zhì)，并置換buffer。然后采用親和層析、尺寸排阻層析、離子對(duì)反相層析、離子交換層析等層析工藝進(jìn)行精制純化，經(jīng)過前述超濾、層析等純化步驟后，mRNA已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌?，再使?0kD/100kD/300kD膜包或中空纖維膜柱調(diào)整原液中mRNA濃度并置換buffer。采用除菌過濾來控制微生物負(fù)荷進(jìn)行暫存封裝。
4、mRNA制劑制備
mRNA-LNP包封制備是mRNA制劑制備的關(guān)鍵工藝，除了脂質(zhì)成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質(zhì)成分的接觸和相互作用過程，通過微流控技術(shù)以形成穩(wěn)定、均一、收率高的mRNA-LNP復(fù)合物。mRNA-LNP溶液通過100kD/300kD TFF技術(shù)進(jìn)行濃縮換液，mRNA-LNP復(fù)合物被截留，乙醇、制劑被洗濾。最后除菌過濾采用0.22μm除菌級(jí)過濾器冗余設(shè)置，截留細(xì)菌等微生物污染物。最終，進(jìn)行無菌灌裝。
mRNA-LNP包封制備是mRNA制劑制備的關(guān)鍵工藝，除了脂質(zhì)成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質(zhì)成分的接觸和相互作用過程，通過微流控技術(shù)以形成穩(wěn)定、均一、收率高的mRNA-LNP復(fù)合物。mRNA-LNP溶液通過100kD/300kD TFF技術(shù)進(jìn)行濃縮換液，mRNA-LNP復(fù)合物被截留，乙醇、制劑被洗濾。最后除菌過濾采用0.22μm除菌級(jí)過濾器冗余設(shè)置，截留細(xì)菌等微生物污染物。最終，進(jìn)行無菌灌裝。
在mRNA技術(shù)在傳染病疫苗領(lǐng)域獲得突破性進(jìn)展的同時(shí)，mRNA技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用也正在展開。我們期待隨著科學(xué)的進(jìn)步和技術(shù)的發(fā)展，mRNA技術(shù)能夠獲得更為廣泛的應(yīng)用，造福廣大病患！
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